样品前处理-细胞破碎

  细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，由于细菌、酵母、真菌、植物都有细胞壁，但成分不同，且同类细胞结成的网状结构不同，因此其细胞壁的坚固程度不同，总体呈现递增态势。动物细胞虽没有细胞壁，但具有细胞膜，也需要一定的细胞破碎方法来破膜，达到提取产物的目的。细胞破碎的方法主要分为化学法和机械法两大类。具体如下：

 化学法  

 渗透冲击破碎法

•方法：渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，运用渗透压的变化引起细胞快速膨胀而破裂。

 反复冻融法  

•方法：将细胞放在低温下冷冻(约-15℃)，然后在室温中融化，反覆多次而达到破壁作用。

 酶溶破碎发法  

•方法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。

 化学试剂法  

•方法：某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内含物有选择地渗透出来。SDS(十二烷基磺酸钠)是典型的阴离子表面活性剂

  机械法  

组织捣碎机

•方法：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

•特点：一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以上。由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。

匀浆器

•方法：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。

•特点：此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

•存在的问题：较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀者，不适合用该法处理。

研磨

•原理：将液氮预冻的样本放入研钵内研磨

•特点：多用于坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。

超声波

•原理：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，超声对细胞的作用主要有热效应，空化效应和机械效应。

•特点：处理少量样本，操作简单，重复性较好，节省时间;多用于微生物和组织细胞的破碎，如用大肠杆菌制备各种酶。

•存在问题：超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活；大容量装置声能传递，散热均有困难，应采取相应降温措施；对超声波敏感和核酸应慎用。

高压匀浆

•方法：利用超高压能量使样品通过狭缝瞬间释放，在剪切效应、空穴效应、碰撞效应的作用下，使细胞破碎。全过程在4~6℃低温循环水浴中进行，保持原有物质活性。

•特点：可连续操作，适合于处理大量样本，主要用于从微生物样本中提取蛋白等胞内产物。

振荡珠击破碎

•方法：将等体积的小量组织样品与高密度的磁珠或钢珠等放入可密封的2ml螺旋盖微量管中，设定振荡速度、振荡时间即可。

•特点：此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法。一台机器最多可以在一天处理2400支样品。适合小量、多样的实验。